晚期NSCLC敏感性关系研究》
讨 论
近年来，随着分子生物学技术的发展和人们从细胞受体及增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步认识，开始了针对细胞受体、关键基因或调控分子为靶点的恶性肿瘤“靶向治疗”。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂作为临床抗肿瘤新药的问世，是以阻断细胞信号转导通路中传递恶性增殖信号的靶分子关键酶活化为探索思路的抑瘤新举措，为靶向治疗肿瘤开辟了一条可行之路。吉非替尼单药确定的疗效和Ⅲ期临床试验的相对失败使人们认识到该药作用效果的多样性、作用机制和决定疗效发挥因素的复杂性，因而筛选更具有针对性的作用人群，寻找预测该药敏感性及治疗预后的生物标记物成为人们试图挖掘该药最大潜能的探索之一。
一、HER（erbB）家族受体及其信号通路的重要意义
EGFR（erbB1/HER1）是吉非替尼特异作用的靶受体。人egfr原癌基因定位于第7号染色体短臂（7p12.3-p12.1），它编码的产物EGFR由1210个氨基酸组成，蛋白分子量约为170kDa，其中，712-979位属于酪氨酸激酶域。EGFR特异的专有配体有表皮生长因子(EGF)、转化生长因子（TGF-α)、双向调节蛋白（amphiregulin）,与其他HER共有的配体有β-cellulin(BTC)、肝素结合型表皮生长因子(heparin-binding EGF或HB-EGF）、表皮调节素Epiregulin(EPR)等。其中EGF、TGF-α对于细胞增殖意义重大。静息情况下，EGFR集聚在膜表面类似胞膜穴样凹陷(caveolae)的膜性结构中，当受到配体的刺激时，穴样凹陷中的受体转位到另一特殊的膜性结构，通过网格蛋白(clathrin)介导的途径内化。当EGFR与EGF结合后，EGF-EGFR复合物内化进入细胞，经早期内体、晚期内体到溶酶体进行降解，从而弱化EGFR介导的信号。TGF- α与EGFR结合形成的复合物内化进入晚期内体后，由于PH值的下降会使配体与受体解离，绝大部分EGFR循环回细胞表面再利用[23]。
EGFR在许多上皮来源的癌细胞中表达或过度表达，在NSCLC中的过表达率约为40-80%[24]，多见于鳞癌。EGFR高表达的肿瘤患者，常预示肿瘤恶性程度高，进展迅速，易复发转移，预后不良[25]。另外，包括NSCLC在内的一些肿瘤中还可检测到EGFR缺失。最常见的EGFR缺失突变型EGFRⅧ失去了配体结合区，但可自身活化酪氨酸激酶，刺激下游信号通路的激活，而不依赖于与其配体结合。EGFR在恶性肿瘤中的过表达和/或突变，借助信号转导而致细胞生长失控和恶性化。EGFR的异常表达还与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移，肿瘤的化疗耐药性等密切相关。
HER2（ErbB2/neu）是HER家族第二个重要受体。编码HER2的基因neu最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到。人类体细胞内neu基因的同源基因位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），它编码的产物HER2由1255个氨基酸组成，蛋白分子量约为185Kda，其中，720-987位属于酪氨酸激酶域。虽然已知的HER家族配体有10余种之多，HER2至今仍未发现高亲和力配体。但是“孤儿受体”HER2有强烈的酪氨酸激酶活性，是该家族其它成员最优先和最佳的二聚体化伴侣，与其它成员形成的异二聚体具有相对更强的信号转导能力，在整个HER家族信号网络中处于中心位置[30]。这种优势与如下机制有关：HER2的强烈酪氨酸激酶活性可明显扩增EGFR或HER3接受的刺激生长的信号作用；HER2可阻碍配体与异二聚体解离而增加配体的亲和力；HER2可降低EGFR内吞及降解率，使异二聚体更稳定；还能促进EGFR再循环。
HER2在多种人类肿瘤中过度表达，据报道在NSCLC中过表达率约为18-60%[24]，多见于腺癌[31]。过度表达的原因主要是HER2基因扩增（95%）或转录增多（5%）。1987年，Slamon等人首先报道了HER2基因扩增和乳腺癌临床预后不良之间的显著关系[32]，其显著性高于雌激素、孕激素等指标，并在以后的研究中得到大量证实。随后，HER2表达水平和乳腺癌治疗效果间的关系得到广泛研究，发现HER2高表达的乳腺癌患者易产生化疗和激素治疗抗性，常提示乳腺癌恶性程度高、转移潜力强，进展迅速、生存期短、复发率高。研究表明，HER2在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移。
HER3受体由C-erbB-3基因编码，C-erbB-3基因最初为Kraus等通过将V-erbB基因与正常人体基因组DNA进行减束杂交后获得。人体该基因定位于染色体12q13上，其cDNA全长6kb。HER3分子量为160kda，其特异配体是神经调节素NRG1、NRG2。HER3是HER家族中较为特殊的受体成员，由于其结构中酪氨酸激酶域的一个关键位点发生了氨基酸残基的置换，功能上只显示很弱或无酪氨酸激酶活性[33]。但目前研究认为该受体与HER家族其它受体偶联后对于调节EGFR和HER2的信号通路、激活胞内信号具有重要意义。它的酪氨酸磷酸化位点有6个可以很好地结合PI3K的YXXMs模序，故可有效地偶联PI3K/AKT信号途径。HER3的表达也与恶性肿瘤的发生和预后有关，它与EGFR、HER2共表达后会使肿瘤恶性程度明显增加。HER3在人类肺癌中的表达率高达25-85%[24]。一组研究显示，晚期NSCLC患者的生存期缩短与HER3高表达有关[34]。
HER4是神经调节素NRG3、NRG4的特异受体，也是NRG1、NRG2、BTC、HB-EGF、EPR以及Tomoregulin的受体。BTC、HB-EGF可以有效地诱导EGFR与HER4相互作用。目前对HER4在肿瘤中的作用研究得较少，HER4在人肺癌中的表达率还未被鉴定。但已发现它在一些肿瘤中高表达，如在卵巢癌中表达率达93%，在一些肿瘤中发现HER4免疫反应性升高和特异性转录[24]。
HER家族四种糖蛋白受体结构上都有一个含有可识别与结合配体及能与其它受体结合形成二聚化环结构域的胞外区、一个含有单个疏水锚定序列并涉及受体间相互作用的跨膜区、一个含有催化性酪氨酸激酶活性结构域和数个具有可磷酸化羧基末端的酪氨酸残基的胞内区。HER家族成员间具有同源性，在酪氨酸激酶区同源性高达60-82%，故两种受体间存在着交叉反应性，这使小分子抑制剂结合两种或更多受体成为可能。
HER受体在胞膜上以无活性的单体形式存在，一般情况下，其激活需配体诱导下彼此形成同源或异源二聚体，后者相对更稳定并使信号转导途径多样化。二聚化作用使受体胞内区酪氨酸残基自身磷酸化激活，磷酸化的残基可作为停泊位点募集含Src同源区SH2和磷酸酪氨酸结合域PIB的信号分子，这些分子作为酪氨酸激酶的底物被活化，继而导致磷酸化级联反应的发生，启动胞内信号转导通路。
HER家族受体信号转导通路是一个非常复杂的网络系统, 其主要信号途径有三条：介导细胞增殖、分化的Ras/Raf/MAPK（丝裂原激活蛋白激酶，如ErK、Jnks）途径; 介导细胞存活和抗凋亡的P13K/AKT（抗凋亡激酶或蛋白激酶B）途径; 介导细胞运动迁移、血管生成、抗凋亡等功能的c-Src/STAT（信号转导和转录激活子)途径。不仅这些主要通路间、主要通路与附加通路间可以交联整合，HER家族通路还可与其它信号转导通路交联整合，因此HER家族受体信号的传递受到多种交互作用的影响。最终其异常激活信号可通过核内转录因子如c-fos、caspase-9、NF-кB等调控的与细胞周期进程、增殖、迁移等有关的基因转录而引起细胞生长增殖失控、恶性转化及肿瘤浸润转移。
HER家族受体及其信号转导通路对于癌症的发生具有重要意义，是EGFR-TKI吉非替尼靶向治疗肿瘤的分子生物学基础。近十余年来对肿瘤细胞HER受体蛋白的检测广泛应用于判断肿瘤恶性程度及预后的临床实践中，大量文献报道了HER受体EGFR/HER2/HER3单独或联合表达与恶性肿瘤不良预后之间的相关性[18, 29, 32,35,36]，其对于预示NSCLC不良预后的意义也被阐明[18,34,37,38]。
二、关于吉非替尼敏感性预测及与HER受体表达关系的探索
吉非替尼通过竞争性抑制EGFR酪氨酸激酶域的ATP结合位点被ATP结合活化，阻断EGFR信号传导系统，切断恶性肿瘤形成过程中的最重要环节，以其在治疗晚期NSCLC的临床研究中显示的效果及可以口服和毒性低的特点，成为投入临床的第一个EGFR-TKI。从研究初期I-II期临床试验[3,39,40]到综合目前全球超过20万例的临床经验显示：吉非替尼单药在初治或复治的晚期NSCLC中的客观有效率达10-27%（西方 9-18%；中国、日本达27%），35-50%或更多的患者肿瘤稳定、症状改善，耐受性好，不良反应较轻。大量研究显示：东方人、女性、腺癌、非吸烟者疗效明显提高。
为追求更大的临床益处，两个大型多中心Ⅲ期临床试验（INTACT1,2）观察吉非替尼与标准化疗联合一线治疗晚期NSCLC的效果，却发现联合治疗与单纯化疗相比无近远期疗效差异[5-6]，提示吉非替尼不能同时与化疗协同叠加疗效，应该单用或与化疗序贯使用。 2003-2004年，在28个国家展开的旨在观察吉非替尼单药延长晚期难治的NSCLC患者生存期的国际多中心III期临床试验（ISEL），总的结果仍令人失望：1692例入组研究者中位生存期无显著性改善（吉非替尼：安慰剂5.6：5.1个月，时序检验P=0.11），未能达预期的生存改善目标[41]。但是，在对342例东方人群亚组的分析中发现：其与安慰剂对照的中位生存期之比为9.5：5.5个月（P=0.01），显示该药可使东方人群生存期明显延长。2006年，Park等对来自日本、韩国和中国(包括台湾)的31篇东方文献进行了回顾[42], 发现亚洲各国数据相似：大部分研究中吉非替尼使肿瘤客观缓解率> 25%, 疾病控制率> 60%,中位生存时间> 6个月,中位TTP> 3个月。表明该药在东方人群中近远期疗效都明显优于西方人，东方人能从该药更多获益。
吉非替尼独特的敏感人群和临床疗效的复杂多样激起了人们广泛的研究兴趣。为什么只有部分人群有效而且效果特好？如何解释特征性敏感人群与吉非替尼疗效的关系？决定吉非替尼敏感性和耐药性的重要因素有哪些？其分子机制是什么？能否找到预测该药敏感性的关键的生物标志物？
HER家族受体尤其是该药靶蛋白EGFR是人们首先关注的潜在标志物。经验证明，EGFR表达的增加在NSCLC中预示着恶性程度增高、预后不良。理论上针对靶蛋白的靶向药效果最可能与靶蛋白的水平相关，靶蛋白表达越高者可能靶向药效果越好。一个例证是：晚期乳腺癌靶向药应用中抗HER2受体的单克隆抗体赫赛汀的疗效就与其肿瘤靶蛋白HER2的表达水平明显相关[43-44]。但与赫赛汀的情况不同，EGFR的表达却常常不能简单地反映吉非替尼的疗效[9-11，45]。对此近年来多项研究一直在探索，不同的研究出现了不同的结果，带来了很多迷惑与争议。但随着这些研究，关于EGFR与同族受体间及与下游信号分子间的联系、它们在肿瘤敏感或耐药不同状态下的信号转导变化等生物学行为、影响EGFR-TKI敏感性的复杂因素的越来越多的分子机制被阐明。
由于HER2是其它受体最佳二聚化伴侣，由它参与形成的异二聚体可表达强烈TK活性而明显扩增EGFR或HER3接受的生长信号，在整个HER家族信号网络中处于中心位置，故最有潜力成为预测该药敏感性指标。由于HER2在乳腺癌中表达明显，早期药物研究多针对乳癌细胞。临床前研究显示，HER2高表达的癌细胞对吉非替尼高度敏感。例如， 2001年Moasser报道吉非替尼抑制HER2驱动的信号和HER2高表达的肿瘤细胞生长[19]；Moulder等报道吉非替尼抑制体内体外HER2过表达的乳癌细胞[46]；2003年，Anido J等证实在有EGFR明显水平的乳癌细胞中只有HER2过表达时才会被吉非替尼抑制；在这些细胞中，吉非替尼不仅直接抑制EGFR，还通过对HER2、HER3的隔绝使它们只能与EGFR形成没有活性的异二聚体[47]。
HER3虽然缺乏内源性TK活性，但与HER2形成的异二聚体被认为具有最强的信号转导和促分裂能力,对于偶联激活PI3K/Akt通路十分重要。据Moasser等的研究[19]，吉非替尼对HER2高表达的肿瘤细胞系的生长抑制作用与EGFR、HER2、HER3的去磷酸化相关，伴随着HER3-PI3K的丧失和抗凋亡激酶Akt活性的下调。这一HER3介导细胞凋亡途径的理论后来被Jeffrey A. Engelman等人证实[21]。最近日本学者Akira等通过建立HER2基因转染的NSCLC细胞系进行吉非替尼敏感实验，发现转染体具有HER2/HER3异源二聚体的组成性结构，经吉非替尼治疗后此种异二聚体形式和HER3的基础磷酸化及与下游信号分子P85的联系显著降低[20]。吉非替尼被认为对P13K/Akt通路的抑制性最强。故HER3与HER2或EGFR协同考察也是一个潜在的预测指标。
虽然临床前研究支持HER2、HER3对预测EGFR-TKI敏感性的意义，但由于吉非替尼上市初期大规模临床研究较少，早期对临床患者基于IHC检测蛋白表达的研究尚无定论，结果易随不同的研究机构、被测人群、采用试剂和观察水准而变异。同EGFR一样，其它HER受体表达似乎也难以成为灵敏的预测指标。
2004年4月-5月，Thomas lynch 等和J.G Paez 等先后在《新英格兰杂志》和《科学》上发表了两篇具有里程碑意义的研究论文，提出EGFR的基因突变可以预测吉非替尼的疗效[48-49]。研究发现：位于EGFR酪氨酸激酶域ATP结合位点附近的氨基酸置换突变或小的框内缺失突变可以导致EGFR在对生长因子信号发生反应时酪氨酸激酶活性明显扩增，这一特点给予了EGFR-TKI非常显著的敏感性。此外，EGFR突变与患者特点惊人相关：突变多发于腺癌、女性和东方人群。2004年7月，William Pao 又补充了EGFR突变在非吸烟者中极其明显频发的证据[50]。此后，大量研究证实[51-59]：频发于女性、非吸烟者的腺癌构成了一个肺癌亚型，此亚型亚洲人多见，癌细胞频繁出现与EGFR-TK域异常激活、促细胞增殖相关的EGFR基因 18-21位外显子突变，尤其是19位缺失突变（约占60%）和21位导致精-亮氨酸置换的L858R错义突变（约占25%）；EGFR-TKI的敏感性与之相关。
EGFR基因突变很好地解释了临床特征与吉非替尼疗效的关系，揭示了临床表型与基因型的内在关联，阐明了一部分人群对EGFR-TKI敏感性明显提高的分子机制，对于预测这部分人群产生好的疗效十分灵敏，多数研究都具有非常显著性意义。此外，它具有重大的病原学意义，促进了人们对具有遗传异质性的肺癌致病机理的分子生物学研究。2005年9月，Tatsuhiro等用比较基因组学高通量分析方法鉴别肺腺癌的基因变异特征，并按这些特征将肺腺癌分为三个亚群，发现这些亚群都与吸烟史、性别和无疾病生存长短相关，显示了肺腺癌中隐藏的复杂的分子致癌途径[58]。2006年5月，Katerina等制造了肺II型细胞19位外显子缺失或L858置换突变的转基因鼠动物模型，在强力霉素的作用下诱导了肺腺癌的发生，这种腺癌可在减少了转基因表达或应用EGFR-TKI埃罗替尼治疗后快速消退。这为EGFR基因突变可致肺腺癌的发生提供了证据[59]。
EGFR基因突变意义的发现还促进了人们对其同族受体HER2基因突变的研究。这些研究[60-61]同样说明：HER2基因Tk域突变也是隐藏在肺腺癌中的重要因素，它与EGFR基因突变惊人相似，多为20位外显子框内插入，也高发于腺癌、女性、非吸烟者。展现了HER2与EGFR在一类肺腺癌致病机制中协同作用的病原学特征。
既然EGFR基因突变可以灵敏预测吉非替尼的反应性，是否意味着应该用基因测序来筛选敏感人群，而忽略HER受体表达及其它因素作为潜在生物标记物的研究意义呢？
事实恰好相反。一些研究者在各自的研究中发现除EGFR基因突变外还有其它因素: EGFR复制（拷贝）数、HER受体成员高表达、Akt基础性磷酸化、k-ras突变等因素影响吉非替尼疗效[62-66]。Vanesa 等发现血浆EGFR值可灵敏预测吉非替尼疗效和无疾病生存[12]。Nobukazu等在鼠肺腺癌、人肺腺癌细胞系等模型中发现光是EGFR基因突变对调控EGFR抑制剂的生物反应性是不够的，依赖于EGFR而生存的肺腺癌通过联合基因突变和EGFR二聚化成员及其配体高表达而基础性活化受体[66]。
最有趣的是，曾于2003年撰文说EGFR、HER2表达不与吉非替尼疗效、生存相关[1]的意大利学者Cappuzzo于2005年又与另一些研究者合作先后发表了三篇研究论文[14,22,67]，相继阐述EGFR、HER2、HER3的基因拷贝数和蛋白表达对吉非替尼疗效和预后的重要意义。研究发现：增高的EGFR基因拷贝数（荧光原位杂交FISH法）和蛋白表达（IHC法）与较好的疗效和生存的延长明显相关；HER2基因拷贝数在EGFR蛋白阳性表达者中与吉非替尼的敏感性相关，HER2蛋白阳性例过少无法统计；HER3基因拷贝数与TTP、女性、非吸烟者明显相关，当与EGFR协同考察时EGFR/HER3双阳性患者比其他患者吉非替尼疗效提高，但不影响生存。此外报道：EGFR基因突变也与疗效和TTP明显相关，但与生存无明显相关，有40%的基因突变者后来进展。多元分析只有EGFR基因拷贝数能预测生存，提出了癌细胞EGFR基因复制水平比突变更多的意义。
紧接着，加拿大学者Tsao等2005年7月发表对EGFR-TKI埃罗替尼与安慰剂对照的III期临床研究（BR.21）结果[13]，又有惊人的发现：在EGFR基因表达（IHC蛋白阳性、FISH基因拷贝数提高）组中，埃罗替尼治疗组比安慰剂组疗效、生存期明显改善，尤其是基因拷贝数对于生存的延长具非常显著性意义；而EGFR基因突变组疗效是安慰剂组的两倍余，但却无统计学意义（16%：7%，P=0.37）。在有EGFR基因突变组中，埃罗替尼治疗组的生存与安慰剂组相比无显著性差异（死亡风险比值0.77，P=0.45），倒是在无EGFR基因突变组中，埃罗替尼治疗组有生存延长倾向（死亡风险比值0.73，P=0.13），该药在总体人群中获得的生存益处（死亡风险比值0.70，P<0.001）主要来自无EGFR基因突变组。多元分析对疗效的影响因素时，只有非吸烟史、腺癌、EGFR表达或基因拷贝数与疗效相关；多元分析对生存的影响则所有指标都不能入选。
以上研究都基于大样本，可信度毋庸置疑。分析这些数据表明：虽然EGFR-TK域的基因突变与更好的疗效相关，但它较好的预后意义并非来自于EGFR-TKI的特效，而是来自于由基因突变趋动形成的肿瘤本身具有较少的侵袭性，此型肿瘤比其它肿瘤恶性度低，易被EGFR-TK靶向药等治疗控制，在化疗甚至安慰剂治疗后都倾向于生存的延长[68]。所以将EGFR基因突变者与非突变者对照疗效提高显著，而将其按接受EGFR-TKI与安慰剂对照则疗效、生存改善都不大。此外，即使是缺乏EGFR基因突变者以及男性、吸烟者、鳞癌患者，他们接受EGFR-TKI后也有生存益处，这些生存益处不能拿基因突变导致的治疗敏感性来解释，说明单纯以基因突变来评估EGFR-TKI的疗效是不够的，基因突变可能更多地影响非吸烟者腺癌的发生和预后，而EGFR基因扩增可能更多地影响吸烟者鳞癌对EGFR-TKI的敏感性。对于预后生存的意义，HER受体尤其EGFR基因拷贝数看起来是更敏感的预测指标；对HER蛋白表达的意义也须重新评估。
关于基因拷贝数的预测意义也得到了另一些研究证明：如Lynch对吉非替尼IDEAL和INTACT的研究、Gumerlock/Hirsch等对西南癌症组SWOG 0126临床试验的研究[69]、Takano等[55]的报道、Han等的报道[65]、Rafal等[70]的研究，等等。EGFR基因扩增与突变是否相关？Takano等实验认为基因拷贝数的增加由选择性等位突变基因扩增所致；而2006年4月，Coldren 等用微量分析法基因表达模式揭示与EGFR-TKI敏感性相关的基因表达类型，发现与吉非替尼敏感性相关的基因表达模式和与EGFR突变相关的敏感性是独立的[71]，二者都有各自的预测意义。2006年7月，一些学者，包括曾发现EGFR-TK基因突变重大意义的研究者在《Clinical Cancer Research》上发表了2005年剑桥讨论会共识[68]：尽管最初热衷的是用基因突变状况作为重要的生物标记物，现已清楚基因拷贝数可增加一大组人群预示生存的额外信息。接受基因拷贝数作为重要的标记物并不减低EGFR突变状况作为那些可能有最好疗效的患者的预测指标。
IHC是一个临床应用广泛的蛋白检测方法，理论上基因的复制增多则相应蛋白的表达增多，从而影响药物作用的靶点数目。在Cappuzzo文章中、BR.21的研究中和SWOG0126的研究中EGFR蛋白表达都与基因扩增的表现一致，显示其不失为具有临床意义的预测指标——这与最初Kris的研究[3,11]和其它一些报道[1,45]相反。为什么会有这种研究差异呢？为什么基因拷贝数不能每次都准确反应到蛋白表达水平呢？众多学者对相关问题进行了讨论，如Hirsch等[72]及Meropol等[73]的评论、Posadas[74]的回顾。
推测可能影响IHC结果准确性的原因包含两个方面，现分析如下：
（一）基于IHC实验检测技术本身的误差
1. 取材的影响：研究中从取材到患者开始接受治疗的时间长短不一，肿瘤可能发生了变异。取材部位、大小可能影响检测准确度：转移瘤比原发瘤更能反映肿瘤受体表达信息。手术切除的组织易取到肿瘤，信息量大；穿刺活检的组织、经多次切片后残存量极少的组织易丢失信息产生假阴性。
2. 组织加工的影响：归档的组织样本在加工、储存过程中可能会产生蛋白质降解。石蜡包埋的组织容易丢失所表达的蛋白，组织在石腊包埋前福尔马林浸泡时间的长短和切片在检测准备前放置时间的长短都可能影响受检蛋白的含量。
3. 定性检测的局限：以观察细胞染色为特点的免疫病理技术，不易定量分析，只能定性判断。以阳性/阴性为结果的定性判定影响准确性。
4. 实验方法缺乏标准化：由于组织固定与处理的差别，抗体间不同的敏感性和特异性，同时运用多种抗体和检测方法难以使其标准化，影响可重复性。结果可能随不同抗体、不同操作技术、不同评分体系、不同阳性截止值而变化,美罗华。如2005年美国临床肿瘤协会初步报告：在一个大肠癌研究试验中来自Zymed实验室的EGFR抗体比DaKo 公司的pharm Dx试剂盒所得到的结果敏感性高[75]。关于评分体系和阳性截止值，许多研究采用HercepTest评分标准，即>10%的中等强度以上染色判为阳性；而另一些研究采用染色强度和染色百分率综合记分法，总分400分，>200分（50%）的中等染色为阳性。有的研究阳性结果等于蛋白过表达，另一些研究报道的结果指任何蛋白表达水平。不同的标准可能引起阳性判定的差异。此外，对不同受检蛋白阳性染色部位的判定存在争议、缺乏适当的对照、对染色强度的人为评价差异、不同实验室制度差异等都可能增加非实验因素对结果的影响，使不同研究之间的可比性和可重复性下降。大样本条件均衡的规范化对照研究可能有助于提高准确性。
（二）基于以单一蛋白指标预测EGFR-TKI敏感性机制的误差
1. 蛋白表达不如基因表达灵敏的机制分析：从EGFR基因扩增到蛋白表达要经过转录、翻译、翻译后加工、修饰，每步都会有相应的调控机制，如启动子CA重复序列长度调节等。是否癌细胞增殖活跃的基因信号反应到蛋白表达上因受细胞蛋白质表达调控的干扰而产生一定的信号失真？是否基因扩增信号更能准确反映对EGFR-TKI抑制效应最重要的细胞EGFR-TK信号通路整体活性状态？
2. 由于影响EGFR-TKI敏感性的是多因素机制，如以单一指标作为预测标准，同时样本含量不够大，其它因素分布不均衡，则单一指标对药物敏感性影响因素容易受到其它影响因素的干扰，造成统计误差。
EGFR与同族受体可形成二聚化，故综合考察EGFR、HER2、HER3的表达状态可能找到更理想的预测指标，提高预测的可靠性。支持EGFR/HER2交互表达预测该药敏感性的报道如：Cappuzzo 等的研究[22]、Koizumi等的研究[76]、Nakamura[77]等的研究，而Kwak等人[78]则认为EGFR/HER2高表达是EGFR突变的EGFR-TKI敏感者继发耐药的指标之一；支持EGFR/HER3交互作用预测意义的报道有：Cappuzzo 的第三篇HER系列文章[67]、Koizumi的研究[76]等；支持HER2/HER3交互表达预测意义的报道有：Hirata等人研究[20]、Engelman等的最新报道。此外，因发现HER3可直接活化PI3K, 介导对吉非替尼敏感的NSCLC中PI3K/AKT的活性，其单一指标持续高水平表达被认为是该药敏感指标之一[68]。
除了上述我们关注的HER受体之间的交互作用的重要影响，目前人们逐渐明确的其它可能影响EGFR-TKI敏感/耐药性的多因素分子机制有：
额外EGFR旁路TK受体活化导致耐药
这些受体有：肝细胞生长因子受体（C-MET）、C-MET相关的酪氨酸激酶（RON）、胰岛素样生长因子受体-1（IGF-1R）、血小板衍生生长因子受体等。它们激活后可不依赖EGFR而活化下游通路调节细胞生存[79]。
血管内皮生长因子（VEGF）促血管生成而耐药
如有同样HER受体表达水平，但VEGF蛋白表达差异，则肿瘤对药物敏感性不同。
EGFR下游信号的组成性活化导致耐药
由EGFR-TK激活引起的基础性AKT活化可能提高吉非替尼敏感性[63]，但不依赖EGFR激活的AKT 组成性活化则使吉非替尼耐药[79]。可致AKT 组成性活化的因素如：PTEN(肿瘤抑制蛋白，一种调节PI3K/AKT通路的脂质磷酸酶)功能丧失[79]。
Src非受体酪氨酸激酶组成性活化，介导细胞生长、存活[79]。
Ras突变导致Raf/MAPK通路活性上调，并提高复杂生存通路活性[79]。
STAT-3组成性活化，不受EGFR-TKI抑制[79]。
EGFR突变影响EGFR-TKI敏感性
EGFR-TK域体细胞活化性突变：可致EGFR组成性活化，压制其它细胞存活信号途径，使EGFR-TKI的敏感性明显提高；耐药性突变：一部分原先对吉非替尼敏感人群可继发EGFR-T790体细胞突变，产生耐药[80]。
其它可能影响吉非替尼敏感性的因素：
E-钙粘蛋白的增加是EGFR-TKI敏感性升高的潜在指标[68]。
有人在埃罗替尼的研究中得出：磷酸化EGFR-AKT比值（p-EGFR：p-AKT）是无EGFR基因突变者最好的疗效指标[14, 81]。
Ono等[82]提出细胞表面EGFR内化增多预示吉非替尼的敏感性；而Kwak等[78]则认为吉非替尼作用下原先突变的敏感细胞出现对EGFR/HER2持续依赖、EGFR内化加剧是一种耐药机制。
其它影响因素：如肿瘤组织类型、信号通路一些分子表达差异等。
大样本条件相对均衡的研究同样有助于减少众多额外因素对要考察的目标指标疗效预测意义的影响。
虽然以IHC法检测HER受体蛋白表达作为可选择的生物标记物倍受争议，但除了几个大样本临床试验的支持，一些专门的研究也显示出受体蛋白表达作为预测标志物的应用前景。最近，Dziadziuszko 设计实验证实[83]：EGFRmRNA与FISH阳性（P=0.001）、EGFR IHC染色阳性（P<0.001）之间呈正相关，指出以FISH和IHC检测的数据都与最好的预测值相关, 选择在一线治疗的回顾性研究中证实这一信息是目前全球范围内一些癌症研究组正在做或计划做的[70]。2006年7月，Engelman报道说[84]：目前有更多的证据表明EGFR与其它HER家族成员（尤其HER2、HER3）协作活化肺癌信号通路。这些发现给予这些肿瘤有关生物学的重要提示，引导鉴别对EGFR抑制剂有效的肿瘤，选择由ErbB信号趋动的肿瘤的治疗。